کلونینگ، بیان و بررسی ایمنی زایی ncsrs2، آنتی ژن سطحی neospora caninum

این مطالعه با هدف همسانه سازی و بیان آنتی ژن سطحی ncsrs2 از انگل نئوسپورا کانینوم در دو سامانه بیانی پروکاریوتی و یوکاریوتی انجام گرفت. پس از تکثیر جایگاه ژنی ncsrs2 و تعیین توالی آن با استفاده از روش ta cloning درناقل ptz57r/t، توالی به دست آمده با توالی سایر سویه های نئوسپورا کانینوم از نظر فیلوژنتیکی مقایسه شدند. نتیجه توالی یابی تحت شماره دسترسی jq410454 دربانک جهانی ژن ثبت شد. آنالیز توالی ژن ncsrs2 بین 98 تا 100 درصد همسانی با توالی های ثبت شده نئوسپورا کانینوم نشان داد. جهت همسانه سازی در باکتری، جایگاه ژنی ncsrs2 با آغازگرهای دارای سایت برشی آنزیم های ecori و sali تکثیر شد و به درون ناقل بیانی pet32a (+) الحاق گردید و پلاسمید نوترکیب حاصل (pet32-ncsrs2) ابتدا جهت تکثیر به باکتری اشرشیا کلی سویه dh5? و سپس جهت بیان پروتئین نوترکیب به باکتری اشرشیا کلی سویه bl21(de3) انتقال داده شد. القای بیان با استفاده از iptg انجام شد. برای همسانه سازی در مخمر pichia pastoris، از آغازگرهای دارای سایت برشی آنزیم های kpni و xbai جهت تکثیر جایگاه ژنی ncsrs2 استفاده شد و فرآورده pcr به درون ناقل بیانی ppicz-b الحاق گردید. پلاسمید نوترکیب حاصل (ppiczb-ncsrs2) به باکتری اشرشیا کلی سویه dh5? انتقال داده شد. پس از غربالگری و تائید صحت همسانه سازی، پلاسمید ppiczb-ncsrs2 با آنزیم pmei خطی شد و با روش الکتروپوریشن به مخمر انتقال داده شد. مخمر نوترکیب در محیط mmh کشت داده شد و بیان پروتئین به کمک متانول تحریک شد. وضعیت بیان پروتئین ncsrs2 در هر دو سامانه بیانی به روش های sds-page، دات بلات و وسترن بلات بررسی گردید. پروتئین های تولید شده استخراج و خالص سازی شدند و فعالیت آنها در محیط آزمایشگاه با آزمون الایزای غیرمستقیم بررسی شد. نتایج این پژوهش نشان داد که ژن ncsrs2 در ناقلین pet32a (+) (باکتری) و ppicz-b (مخمر) به درستی همسانه شده است. ورود ژن ncsrs2 به باکتری bl21(de3) به روش-های کلنی pcr و هضم آنزیمی تأیید شد. ورود ژن ncsrs2 به داخل ژنوم مخمر پیشیا پاستوریس با روش نوترکیبی همولوگ با استخراج dna ژنومی مخمر و انجام pcr تائید شد. بیان پروتئین ncsrs2 در باکتری و مخمر به روش وسترن بلات با مشاهده باند اختصاصی پروتئین هدف تأیید شد. با توجه به انجام واکنش بین پروتئین های تولید شده در این سامانه های بیانی و آنتی بادی اختصاصی نئوسپورا کانینوم در محیط آزمایشگاه می توان گفت احتمالاً این پروتئین ها توانایی ایجاد ایمنی حفاظتی علیه انگل نئوسپورا کانینوم را خواهند داشت. به طور کلی می توان گفت که در این تحقیق ژن ncsrs2 با موفقیت در سامانه-های بیانی پروکاریوتی و یوکاریوتی همسانه و بیان شد به نحوی که پروتئین های تولید شده احتمالاً قادر به تحریک سیستم ایمنی علیه انگل نئوسپورا کانینوم و پیشگیری از انتقال آلودگی می باشند.